启动子区多位点突变揭示植物homeobox基因保守的多效性功能 | Cell Press青促会述评

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2021年第七期（总第44期）专栏文章，由中科院遗传与发育生物学研究所助理研究员 肇涛澜，就Cell 中的论文Conserved pleiotropy of an ancient plant homeobox gene uncovered by cis-regulatory dissection发表述评。

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基因功能的分化是进化的重要动力。例如决定鸟翅膀和狗前肢形成的基因同源，但它们的功能已出现了明显的分化。然而，准确评估基因功能分化较为困难，尤其当一个基因具有多种功能时。因为多功能基因通常需要多个等位突变体(同一基因不同突变位点的突变体)来展示其全部的调控功能；即位于某基因位点I处的突变体呈现一种突变表型，而位于该基因位点II处的突变体呈现另一种突变表型。遗憾的是，现有条件下，每个基因对应的等位突变体数目极少，仅能展示基因的部分调控功能，这会导致功能保守的基因被误判为功能分化的基因。此外，位于编码区的突变常产生发育早期的致死表型，从而无法检测基因在发育晚期的调控功能，导致具有部分功能分化的基因被误判为功能保守的基因。

在本期Cell中，冷泉港实验室联合霍华德·休斯医学研究所等多家研究机构，通过高通量CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技术筛选茄科和十字花科植物WOX9 （WUSCHEL HOMEOBOX9）基因启动子区的非致死突变体，发表题为“Conserved pleiotropy of an ancient plant homeobox gene uncovered by cis-regulatory dissection”的研究论文。文章发现WOX9启动子区存在多段顺式序列元件可调控基因的多效性功能，且这种多效性基因功能在物种间保守。

WOX基因家族非常重要，其通过调控分生组织中干细胞的产生和成熟来控制植物的生长发育。拟南芥wox9功能完全缺失突变体呈现胚胎致死表型。而番茄WOX9同源基因的突变体却呈现由于生殖分生组织过度增殖而导致的花序过度分枝表型。为研究不同物种中WOX9基因的功能差异是否由不同等位突变造成，研究者利用高通量CRISPR编辑系统（该系统可同时靶向编辑8个基因位点）在番茄中构建了大量WOX9启动子区等位突变体。同时，研究者采用ATAC-seq（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing）技术检测番茄分生组织内染色质开放状态，发现在WOX9启动子内主要存在四个染色质开放区。研究者将包含临近起始密码子的开放区1的一段序列称为区段I（pro-Reg1），将包含开放区2和3的一段序列称为区段II（pro-Reg2，图1A）。突变位点在区段I内部的突变体大多存在营养生长异常表型，如胚胎致死、顶端分生组织停止生长；而突变位点在区段II内部的突变体大多存在生殖生长异常表型，如花序过度分枝（图1）。上述结果表明番茄WOX9基因具有多效性功能，且这种多效性被基因启动子区不同位置的顺式序列元件调控。

▲图1 番茄WOX9基因启动子区段I和区段II分别调控胚胎和花序发育过程

为了研究WOX9基因的多效性功能在进化过程中是否保守，研究者首先在植物中建立了一个保守的非编码序列库（CNSs, conserved non-coding sequences）。利用此数据库分析发现，启动子区段 I和II在茄科植物间具有高度的序列保守性（图2 A－F）。选取茄科另一可遗传操作物种地莓，在其WOX9同源基因启动子区段I和II进行高通量CRISPR编辑，发现位于区段I的突变体呈现顶端分生组织终止生长的表型，位于区段II的突变体则呈现多分枝、多花瓣等表型（图2 G－J）。这些结果表明，WOX9的多效性功能和调控它们的顺式元件序列在茄科植物中均保守。

▲图2 WOX9基因的多效性功能在番茄近缘物种地莓中保守

为了进一步研究WOX9基因的多效性功能在非茄科物种中是否依然保守，研究者通过CNSs比较十字花科和茄科植物WOX9启动子区序列，发现在拟南芥和番茄WOX9启动子区存在24个高度保守的短序列（10－30 bp）。拟南芥wox9亚纯和突变体呈现弱顶端分生组织终止的表型；拟南芥wox9敲降突变体（表达量下调程度类似番茄启动子区段II突变体）呈现花序分生组织过量增殖的表型（图3）。这些结果表明，WOX9基因的营养生长和生殖生长调控功能在不同科属物种间高度保守。

▲图3 WOX9在花序发育中的功能在拟南芥中得以保留

研究基因功能通常需要构建突变体。位于编码区的突变常会产生致死表型的突变体，阻碍对发育后期基因功能的研究与探索。针对这一问题，构建突变位点位于启动子等非编码区的突变体为基因功能的全面研究提供了一种有效的解决方案。这些非致死突变体更易于显露基因的多效性功能，并可揭示基因功能的精准顺式调控元件，为广泛探索进化过程中基因功能分化和保守性分析奠定研究基础。此外，基因顺式调控区的突变相对于编码区突变可产生更精确的表型变化，因此在作物驯化和改良方面存在更多优势。未来对基因功能调控区高覆盖度的研究可以实现同时定义、划分和定量调节多效性基因的功能，为精准基因组编辑在农业上的应用打开大门。

论文摘要

基因功能的分化是进化的标志，但是评估长进化尺度内的功能分化极为不易。可用于跨物种研究的少数等位基因通常无法展现基因的全部功能，从而可能掩盖深藏于基因背后的保守多效性功能。在本文中，我们探索了WUSCHEL HOMEOBOX9（WOX9）基因的功能分化，此基因曾被推测在胚胎和花序发育过程中具有物种特异性功能。利用顺式调控编辑系统，我们在番茄中建立了一个全面的等位突变群体，揭示了隐藏的WOX9基因的多效性功能。对染色质开放区和保守顺式调控序列的分析确定了调控基因多效性功能的区域，该区域的功能在番茄近缘物种地莓中保守存在。在茄科远缘物种拟南芥中模拟这些启动子区的等位突变，发现可产生新的花序表型，说明WOX9基因的多效性功能是高度保守的。我们认为有针对性地在启动子顺式调控区进行突变有助于揭示保守的基因功能并减少作物改良中的不良效果。

Divergence of gene function is a hallmark of evolution, but assessing functional divergence over deep time is not trivial. The few alleles available for cross-species studies often fail to expose the entire functional spectrum of genes, potentially obscuring deeply conserved pleiotropic roles. Here, we explore the functional divergence of WUSCHEL HOMEOBOX9 (WOX9), suggested to have species-specific roles in embryo and inflorescence development. Using a cis-regulatory editing drive system, we generate a comprehensive allelic series in tomato, which revealed hidden pleiotropic roles for WOX9. Analysis of accessible chromatin and conserved cis-regulatory sequences identifies the regions responsible for this pleiotropic activity, the functions of which are conserved in groundcherry, a tomato relative. Mimicking these alleles in Arabidopsis, distantly related to tomato and groundcherry, reveals new inflorescence phenotypes, exposing a deeply conserved pleiotropy. We suggest that targeted cis-regulatory mutations can uncover conserved gene functions and reduce undesirable effects in crop improvement.

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述评人简介

肇涛澜

中科院遗传与发育生物学研究所助理研究员

[e-mail]

肇涛澜，中科院遗传与发育生物学研究所助理研究员，The Innovation期刊编辑。近年来针对基因翻译调控和转录调控领域的重要问题开展系列研究工作，成果在Genome Biol.、Genome Res.、PLoS Genet.、Plant Cell等杂志发表。

Taolan Zhao is an assistant researcher at the Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences. Her major focuses are the studies of translation regulation and transcription regulation, and the results have been published in Genome Biol., Genome Res., PLoS Genet., Plant Cell, etc.

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原文刊载于CellPress细胞出版社

旗下期刊Cell上，

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